Phagothérapie: combattre les bactéries à l’aide de virus modifiés

L’utilisation de phages contre les bactéries pathogènes a été envisagée avant même le développement des premiers antibiotiques. À l’heure de l’augmentation des résistances aux antibiotiques, la phagothérapie suscite aujourd’hui un regain d’intérêt. Cette évolution est soutenue par les progrès de la biotechnologie, qui permettent désormais de résoudre d’anciens problèmes liés à la phagothérapie.

La crise des antibiotiques, liée à l’augmentation des résistances bactériennes, entraînera un nombre considérable de décès dans le monde entier au cours des prochaines années. D’ici à 2050, le nombre de victimes pourrait passer des 700000 actuelles à 10 millions, selon le Pr Martin J. Loessner, microbiologiste à l’École polytechnique fédérale de Zurich (EPFZ). De nombreuses avancées dans le domaine de la biologie moléculaire donnent toutefois des raisons d’espérer. Cela concerne notamment les nouvelles évolutions dans le domaine de la phagothérapie ainsi que des endolysines codées par les bactériophages.

Les bactériophages sont connus depuis plus de 100 ans. Le concept consistant à utiliser ces virus de manière ciblée contre les bactéries est tout aussi ancien. Les phages se fixent aux bactéries et injectent leur ADN dans la cellule. Ils induisent ainsi la production de copies d’eux-mêmes au sein de la bactérie, ce qui conduit finalement à la mort de celle-ci et à la libération de nouveaux phages. «Les phages sont les seuls virus qui, lors de leur réplication, ne pénètrent pas complètement dans la cellule hôte», a expliqué M. J. Loessner.

Un agent anti-Listeria: des virus au service de la sécurité alimentaire

Les phages sont aujourd’hui utilisés aussi bien dans le biocontrôle que dans le traitement thérapeutique. Selon M. J. Loessner, on parle de biocontrôle partout où il n’est pas question d’applications médicales. Par exemple, le phage P100 est extrêmement efficace pour éliminer les Listeria, en particulier les souches pathogènes 1, 2 et 4. Cela doit toutefois se faire directement dans l’aliment, car le phage ne peut plus atteindre les Listeria intracellulaires une fois celles-ci installées chez l’être humain. Lorsque le P100 est ajouté au cours de l’affinage du fromage, les Listeria éventuellement présentes disparaissent complètement en quelques heures. Des préparations commerciales de phages contre les Listeria, mais aussi contre les salmonelles et E. coli, sont autorisées dans de nombreuses régions du monde et utilisées dans l’industrie agroalimentaire. La seule exception reste l’UE, où les autorités compétentes s’y opposent depuis plus de 20 ans, selon M. J. Loessner. Certains pays ont contourné ces réglementations supranationales sans passer par Bruxelles, tandis que d’autres continuent d’exprimer des réserves.

La phagothérapie, c’est-à-dire l’utilisation des phages en médecine, remonte déjà aux années 1920, mais elle est largement tombée dans l’oubli avec l’essor des antibiotiques dans les années 1930 et 1940. Ce n’est qu’avec l’apparition des premières souches bactériennes multirésistantes que l’intérêt pour les phages a ressurgi. M. J. Loessner explique: «Ces dernières années, nous avons observé une forte augmentation des applications couronnées de succès. La Belgique et désormais aussi le Portugal ont officiellement autorisé la phagothérapie.»

Les exigences applicables aux phages

La phagothérapie est aujourd’hui considérée comme très sûre.¹ Parmi ses domaines d’application figurent les infections des tissus mous, les infections topiques, les brûlures ou encore les infections des muqueuses. Les méthodes et techniques de la microbiologie moderne permettent aujourd’hui une sélection des virus beaucoup plus ciblée qu’il y a encore quelques années. Les phages doivent couvrir un large spectre bactérien et présenter une activité exclusivement lytique, ce qui signifie qu’ils ne peuvent pas s’intégrer dans le génome bactérien. Les phages destinés à une utilisation chez l’homme doivent au préalable être entièrement séquencés. Tout facteur de virulence ainsi que toute pathogénicité potentielle pour l’humain doivent être exclus. Les phages ne doivent pas non plus provoquer de transduction latérale de l’ADN bactérien. Cela pourrait en effet conduire, par exemple, à la dissémination par le traitement de gènes codant pour certaines toxines. M. J. Loessner continue: «Si l’on n’y prend pas garde, on ouvre la boîte de Pandore.»

Parmi les autres exigences applicables aux phages destinés à un usage clinique figurent notamment la possibilité d’une production à grande échelle, une stabilité suffisante et, finalement, l’autorisation des autorités réglementaires. Cette dernière constitue un obstacle majeur. M. J. Loessner explique: «On ne peut pas simplement faire cela – sauf peut-être dans le cadre d’un ‹compassionate use›.»

Produire des phages de manière ciblée

De nombreux facteurs compliquent la sélection de phages adaptés. Beaucoup sont spécialisés sur un spectre d’hôtes très restreint ou se montrent relativement peu agressifs envers leurs hôtes. Selon M. J. Loessner, ce dernier aspect s’explique par des mécanismes évolutifs. Les phages qui tuent tous les hôtes potentiels le plus rapidement possible finissent par subir un désavantage sélectif. Par ailleurs, des résistances de l’hôte peuvent apparaître relativement rapidement.

Les technologies modernes permettent toutefois de contourner ces problèmes en abandonnant l’identification de phages naturels au profit d’une production quasi «sur mesure» par «ingénierie génomique». «L’objectif est de modifier les virus afin qu’ils présentent les propriétés souhaitées», continue M. J. Loessner.

Deux techniques existent pour cela: la méthode classique repose sur une bactérie dans laquelle est introduit le gène phagique souhaité. Lorsque cette bactérie est infectée par des phages, une recombinaison se produit, permettant l’intégration du gène dans certains des nouveaux phages produits. L’inconvénient de cette méthode réside dans le très faible rendement en virus modifiés. Une méthode plus moderne consiste à isoler l’ADN des phages, à le modifier, puis à réactiver les phages contenant cet ADN modifié. Cette technologie, disponible seulement depuis quelques années, permet de produire en six à dix jours des phages dont le matériel génétique peut théoriquement être modifié à volonté.

Un exemple est la modification de phages tempérés qui, en raison d’une région de contrôle lysogénique dans leur génome, tendent davantage à s’intégrer dans le patrimoine génétique bactérien qu’à provoquer une lyse. La suppression de cette région de contrôle rend le phage virulent. Cette modification peut encore être renforcée par l’ajout d’éléments supplémentaires. Par exemple grâce à des gènes aidant le phage à détruire la paroi cellulaire bactérienne. Une telle modification d’un phage dont le type sauvage ne réduit que faiblement la charge bactérienne d’une culture conduit finalement à la destruction complète de cette culture.²

La limite de cette méthode est définie par la taille du génome phagique, qui peut dépasser 200000 bases chez certains de ces virus. À partir d’une taille de 70000 à 80000 bases, la synthèse du génome devient problématique. Les ciseaux génétiques CRISPR-Cas9 permettent ici d’apporter une solution. M. J. Loessner explique: «Une enzyme CRISPR est une nucléase génétiquement programmable. Elle ne coupe qu’à un seul endroit précisément défini. Nous avons programmé des enzymes CRISPR de manière à ce qu’elles détruisent les phages de type sauvage et ne laissent subsister que les phages génétiquement modifiés. Nous pouvons ainsi obtenir une sélection très rapide.» Grâce à ces techniques, il a été possible de produire un phage qui non seulement détruit les Listeria, mais produit également l’enzyme lysostaphine, capable de détruire la paroi cellulaire des staphylocoques.³ «C’est quelque chose qui n’existe pas dans la nature. Il n’existe aucun phage naturel capable d’attaquer deux bactéries aussi différentes», selon M. J. Loessner.

La phagothérapie fait son retour en clinique

Des essais cliniques utilisant de tels phages sont notamment en préparation dans l’indication des infections urinaires associées aux cathéters (CAUTI). L’un des problèmes de ces infections réside dans leur caractère souvent polymicrobien, avec l’implication simultanée de différents agents pathogènes à Gram positifs et à Gram négatifs. Les agents pathogènes les plus fréquents sont Enterococcus faecalis, Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. À l’EPFZ, des «self-targeting HEPT» («heterologous effector phage therapeutics») ont été développés pour traiter ces infections; en plus de leur activité phagique, ils exercent également une action bactéricide par la production d’enzymes. Cette approche vise aussi à éliminer les rares bactéries capables d’échapper aux phages en développant une résistance.

Cela a notamment été démontré avec le phage E2::colE7, qui non seulement tue E.coli par infection, mais libère également une colicine – une nucléase attaquant les bactéries de l’extérieur. Cette approche empêche la population bactérienne de se rétablir après une activité phagique initialement élevée en raison du développement de résistances. Ce phage permet une éradication complète et durable de E. coli en quelques heures. Des résultats comparables ont été rapportés pour le phage K1::kvarM dans la lutte contre Klebsiella pneumoniae.⁴

Ces phages doivent désormais être étudiés dans le cadre d’un essai clinique humain mené en collaboration avec l’Hôpital universitaire de Zurich auprès de 300 patient·es. La seule exigence posée par Swissmedic concernait les «good manufacturing practices» (GMP); l’utilisation de phages génétiquement modifiés a été acceptée.

Le «cross-targeting HEPT» constitue une étape supplémentaire par rapport au «self-targeting HEPT». Lors de l’élimination d’une bactérie cible, des facteurs capables de tuer d’autres bactéries sont alors libérés.Cela permet d’élargir considérablement le spectre d’action d’un phage. Dans le cadre du projet CAUTI, des phages ont été développés pour agir contre les entérocoques et éliminer E. coli ou K. pneumoniae. Un autre phage actif contre E. coli élimine également E. faecalis.⁴ M. J. Loessner explique: «C’est exactement ce dont nous avons besoin pour traiter les infections urinaires polymicrobiennes.»

Développements complémentaires

Une autre application potentielle des phages génétiquement modifiés réside dans l’immunomodulation. Grâce à des phages modifiés en conséquence (ImmunoPhage), il est possible non seulement d’infecter des bactéries pathogènes, mais aussi, lors de leur destruction, de libérer des peptides immunomodulateurs capables de stimuler le système immunitaire. Certaines interleukines, certains interférons ou certaines chimiokines peuvent servir d’effecteurs immunitaires. L’objectif est une stimulation locale du système immunitaire. Selon M. J. Loessner, les premières données issues de modèles animaux sont extrêmement prometteuses, mais n’ont pas encore été publiées.

Des travaux portent également sur la modification des adhésines, c’est-à-dire des «petites pattes» grâce auxquelles le phage se fixe à sa cellule hôte. Celles-ci nécessitent des structures spécifiques à la surface de la membrane bactérienne et sont propres à chaque bactérie. Le phage ne peut donc infecter qu’une bactérie spécifique. Grâce à la biologie structurale et à l’intelligence artificielle (AlphaFold), il est désormais possible de prédire quelles structures d’une adhésine de phagique sont nécessaires à la reconnaissance de la bactérie. Cette approche a permis de produire des phages à large spectre capables, par exemple, d’infecter toutes les sérovariantes de Listeria.⁵

Les «nanophages» constituent la plus récente avancée de la recherche sur les phages. Il s’agit de phages dont les adhésines sont couplées à des nanocorps. Les nanocorps correspondent à des chaînes lourdes d’anticorps de camélidés. Les Camelidae se distinguent des autres mammifères par le fait que leurs anticorps ne possèdent pas de chaînes légères et que leurs chaînes lourdes sont fonctionnelles même isolément. Cette approche permet de modifier les adhésines pratiquement à volonté. Selon M.J. Loessner, il pourrait à l’avenir devenir possible, par cette méthode, d’infecter et de détruire des cellules cancéreuses humaines à l’aide de phages. Cependant, il reste encore un long chemin à parcourir avant d’y parvenir. Jusqu’à présent, il a été possible, en laboratoire d’infecter et de détruire à l’aide de nanophages des souches de E. coli résistantes aux phages. Les données correspondantes ont été soumises pour publication.

Des phages lumineux pour un diagnostic rapide en laboratoire

Les phages peuvent également être utilisés à des fins diagnostiques. Les phages dits «rapporteurs» contiennent des gènes codant pour des enzymes luminescentes, les luciférases. La luciférase est ainsi produite dans les bactéries infectées, ce qui entraîne leur luminescence. Différentes luciférases sont désormais disponibles. M. J. Loessner a souligné les avantages d’une luciférase appelée NanoLuc, issue à l’origine du krill des profondeurs et produisant une lumière très intense. Il s’agit en outre d’une très petite molécule, associée à une information génétique réduite, ce qui facilite son intégration dans les phages. NanoLuc émet une lumière environ 1000 fois plus intense que les autres luciférases, ce qui permet même la détection de bactéries isolées.⁶ Dans le cadre du projet de phages CAUTI, tous les phages utilisés ont également été développés sous forme de phages luminescents. À partir d’un simple test de laboratoire réalisé sur un échantillon d’urine, il est ainsi possible de déterminer en moins de deux heures quels phages sont adaptés, dans un cas individuel, pour infecter les bactéries présentes.⁶

Les endolysines phagiques isolées constituent une autre option thérapeutique. Le phage a besoin de ces hydrolases pour sortir de la cellule hôte après une réplication réussie, en dissolvant de l’intérieur la membrane cellulaire de la bactérie. Ces endolysines peuvent également être utilisées indépendamment des phages complets, car elles sont hautement spécifiques de la bactérie cible concernée. Cela s’explique par le fait qu’elles ciblent les ponts peptidiques situés entre les sucres de la membrane bactérienne et spécifiques à chaque bactérie. Selon M. J. Loessner, l’un des avantages de ces endolysines phagiques réside dans le fait que les bactéries ne peuvent pas développer de résistance contre elles, car les structures de la paroi cellulaire bactérienne ne se modifient pas, ce qui empêche toute adaptation. En outre, leur action est indépendante du métabolisme bactérien. Ce n’est que dans des cas exceptionnels que les bactéries peuvent se protéger des endolysines, par exemple par la formation d’une capsule. Les bactéries à Gram négatif ne peuvent toutefois pas être attaquées de l’extérieur par les endolysines en raison de leur membrane externe constituée de lipopolysaccharides. En raison de leur grande spécificité, les lysines phagiques ne sont toxiques ni pour les autres bactéries ni pour les membres souhaités du microbiome.

Certains obstacles à l’utilisation des endolysines ont désormais pu être surmontés. Ainsi, il a été possible d’attaquer efficacement un biofilm grâce à l’association d’une endolysine et d’une dépolymérase de polysaccharides.⁷ Même le Staphylococcus aureus intracellulaire peut être atteint à l’aide d’endolysines modifiées.⁸ Les premiers essais cliniques utilisant cette technologie sont en cours.

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